Спиннинг-диск микроскопия. Конфокальная микроскопия

В конфокальном микроскопе, благодаря пинхолу, проводится детекция флуоресценции в одном участке объекта, находящемся в фокусе, с минимальным влиянием флуоресценции окружающих участков за счет перестройки оптической системы в каждый момент времени. Такой способ позволяет значительно повысить разрешающую способность микроскопа по всем трём осям, и избежать засвечивания от подлежащих слоёв образца и слоёв лежащих над плоскостью наблюдения. В качестве источника света используется лазер. За объективной линзой находится небольшая диафрагма. Это нужно чтобы испускаемый свет, проходил через нее и регистрировался, а свет других точек, задерживался диафрагмой и лазер освещает не все поле зрения. В результате визуализация проводится в рамках одного оптического среза. В ходе работы проводится съёмка серии оптических срезов образца или перестройки, на основании чего можно получить его трёхмерную реконструкцию^[1]. Однако необходимость сканирования множества участков замедляет процесс работы, и конфокальный микроскоп может получить всего несколько изображений в секунду^[2]. Ещё одним фактором, замедляющим работу конфокальных микроскопов, является переход от одного оптического среза к следующему. Сканирующие конфокальные микроскопы, как правило, основаны на следующем принципе: образец фиксируется на определённом уровне, изображение считывается под контролем гальванометрического сканера, затем образец перемещается по вертикальной оси и процедура повторяется^[1]. Ускорить процесс сканирования можно сократив затраты времени на каждую точку, однако это снижает чувствительность метода и соотношение сигнал/шум. Скорректировать падение чувствительности можно было бы путём повышения интенсивности освещения, но в этом случае возможно повреждение образца светом и его обесцвечивание^[3].

В системе конфокальной микроскопии единичный пинхол системы заменяется множеством пинхолов, обеспечивающих освещение и получение изображений многих точек образца единовременно. Эти пинхолы расположены на вращающемся по спирали, обеспечивая, в итоге, равномерное освещение образца^[4]. Чтобы между отверстиями не происходило засвечивания, они должны находиться на расстоянии, равном десяти их диаметрам, друг от друга^[1]. С помощью подобных систем можно получить изображение препарата гораздо быстрее - за одну секунду конфокальные микроскопы на основе системы позволяют получать десятки и сотни изображений.

Конфокальная микроскопия сочетает возможность наблюдения тонких оптических срезов, с высокой чувствительностью флуоресцентной микроскопии. Метод хорошо подходит для исследований динамики цитоскелета, движения везикул и органелл, и других задач, связанных с прижизненным наблюдением клеток. Он является более щадящим по отношению к живым клеткам благодаря тому, что продолжительность освещения каждого участка образца значительно сокращается по сравнению обычным конфокальным микроскопом. Систему можно собрать как на прямом, так и на инвертированном микроскопе, но, всё же, предпочтительно использовать инвертированный^[2], поскольку такой дизайн микроскопа позволяет исследовать живые объекты и культуры клеток.

Для съёмки изображений, получаемых путём микроскопии, может использоваться конфокальный микроскоп c камерой ПЗС, а не детекторы на основе фотоумножителей. Детекция с использованием фотоумножителя позволяет значительно усилить сигнал, но создаёт дополнительные шумы. Охлаждаемые ПЗС-камеры микроскопа, напротив, позволяют получать прижизненные изображения крупного формата, с меньшим количеством шумов^[4].

Двойная конфокальная система был предложен компанией Yokogawa Electric Corporation. Вторая фокусирующая система при этом расположена так, чтобы встроенные в него линзы располагались перед отверстиями на первом, он осуществляет фокусирование света. Сейчас это наиболее распространённые системы для сборки конфокальных микроскопов. Размер используемых в них пинхолов фиксирован, он оптимален 100× увеличения. Пинхолы систем Yokogawa имеют диаметр 50 мкм, через каждый из них может быть получено изображение фрагмента оптического среза диаметром 500 нм. Синхронизация скорости и длительности съёмки определяет качество изображения^[4].

При использовании эффекта полного внутреннего отражения (TIRF) микроскопа можно получить сведения о процессах, происходящих в тонком поверхностном слое образца, например, непосредственно под мембраной. Для этого используется рассеяние небольшого количества света в виде затухающей волны при полном внутреннем отражении лазерного луча на границе раздела сред. Система, работающая на данном принципе, может быть объединена с системой в составе одного конфокального микроскопа. Для переключения между режимами необходима турель, удаляющая фильтры при микроскопии с использованием системы переключения между камерами. Методики активного освещения - фотообесцвечивание, фотоактивация и фотоконверсия флуорохромов, предназначены для исследования динамических процессов в клетке. Они могут быть реализованы на микроскопе, оснащённом данной системой лазерной сканирующей микроскопии, с использованием отдельных источников света. В сканирующих конфокальных системах фотообесцвечивание проводится с помощью того же лазера, что и получение изображения за счёт изменения его интенсивности, в результате одновременно проводить эти процедуры нельзя, что затрудняет исследование молекул с высокой подвижностью^[4]. Для качественной обработки полученных изображений требуются большие вычислительные мощности компьютера. Производители медицинского оборудования выпускают новейшие образцы данного вида оборудования, которые разделяют лазерный луч возбуждения и люминесценцию. Оборудование получило широкое применение в области биофизики, медицины, молекулярной и клеточной биологии.

Таким образом, спиннинг диск конфокальная микроскопия - представляет собой экономичный и точный способ исследования биологического материала с высоким разрешением, во многом заменяющий конфокальную микроскопию, прежде всего при решении задач, связанных с наблюдениями за живыми объектами. Развитие метода и разработки компании Andor позволили создать конфокальные системы, позволяющие работать без использования лазерных источников света, что снизило стоимость оборудования для исследований подобного класса.

 

1. Wilson T. Spinning-disk microscopy systems / Cold Spring Harb Protoc. 2010. - 2010. - V.11.
2. Thorn K. Spinning-disk confocal microscopy of yeast / Methods Enzymol.- 2010. V. 470.- P.581-602.
3. Winter PW, Shroff H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging / Curr Opin Chem Biol. - 2014. - V.20. - P. 46-53.
4. Stehbens S, Pemble H, Murrow L et al. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods Enzymol. - 2012. - V.504. - P.293-313.

 

 

 

 

Микроскоп Nikon. Изображение дендритной клетки, выделенной из костного мозга, экспрессирующей химерный белок MHC II -GFP ( 5 мкм). Vyas JM. Insights into dendritic cell function using advanced imaging modalities / Virulence. - 2012. - V.3, N.7. - P. 690-694. Конфокальная микроскопия

 

 

Прижизненное изображение распределения нейтрофилов в эмбрионе D. rerio. A,B - конфокальная микроскопия, C, D. Lam PY1, Fischer RS, Shin WD, Waterman CM, Huttenlocher A. Spinning disk confocal imaging of neutrophil migration in zebrafish / Methods Mol Biol. - 2014. - V.1124. - P.219-33. 

Обычные классические микроскопы не всегда эффективны при проведении сложных исследований. Если для наблюдения крупных объектов их качеств бывает достаточно, то для исследования клеток они дают искажения. Конфокальные приборы лишены многих недостатков обычного микроскопа. В них есть важный элемент – диафрагма, – который отсекает поток фонового рассеянного света.

Каждую единицу времени регистрируется изображение только от одной точки объекта. Это реализуется за счет диафрагмы микроскопа, расположенной за линзой объектива. Она пропускает свет от одной точки, а свет от других точек задерживается. В следующий момент времени оптическая конфокальная система перестраивается (либо перемещается образец), и в диафрагму попадает свет от другой точки. Затем эти точки складываются в единую картину.

Лазером освещается не весь образец, а только определенная его точка, свет от которой и попадает в диафрагму. Соседние области становятся вторичными источниками света, однако диафрагма их отсекает. Регулируя диаметр диафрагмы, наблюдатель может точно устанавливать толщину оптического слоя у фокуса лазерного луча. Тем самым обеспечивается более качественное изображение по оси Z, что является проблемой для многих обычных микроскопов.

Управляет оптической системой компьютер. Наблюдателю не нужно смотреть в окуляр: изображение обрабатывается программой и выводится на экран монитора. Очень важно правильно установливать микроскопы, так как они чувствительны к вибрациям. Для удобства работы и передачи информации, компьютер микроскопа оснащается USB-портами и возможностью подключения к локальной сети и Интернет. Жесткий диск должен быть вместительным, чтобы хранить большое количество информации.