Медико-биологические микроскопы Nikon
Москва
+7 (495) 787 40 46
Санкт-Петербург
+7 (812) 305 06 06

Системы визуализации

Микроскопия визуализации времени жизни флуоресценции (fluorescence-lifetime imaging microscopy, FLIM):

Рассмотрим системы визуализации в современной микроскопии. Методы флуоресцентной микроскопии занимают особое место в технологиях исследования биологических объектов. Для работы с клетками и тканями применяются системы, флуоресцентные метки, в биологическом материале присутствуют эндогенные флуорохромы. Ароматические аминокислоты (тирозин, триптофан, фенилаланин), структурные белки (эластин, коллагены), кофакторы белков, такие как NAD(P)H и FAD, меланин, FMN или рибофлавин липиды и порфирины[1], [2]. Спектры эмиссии флуоресцентных меток и эндогенных флуорохромов могут перекрываться. Помимо спектра и интенсивности флуорохромы характеризуются длительностью жизни флуоресценции. Флуоресценция - стохастический процесс. В некоторых временных рамках, измеряемых наносекундами, флуорохром пребывает в возбуждённом состоянии, и, затем, испускает фотон. Время жизни флуоресценции определяется как среднее время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед своим возвратом в исходное состояние. На него влияет не только химическая природа флуорохрома, но и условия, в которых он находится[2]. Время жизни флуоресценции зависит от показателя преломления и температуры среды[3]. На время жизни флуоресценции влияют pH и pO2, однако концентрация флуорохрома и квантовый выход флуоресценции мало сказываются на продолжительности свечения[1].

Многие флуорохромы имеют сходные спектры, но разную продолжительность флуоресценции.[1]

Микроскопия визуализации времени жизни флуоресценции (fluorescence-lifetime imaging microscopy, FLIM) оценивает пространственное распределение флуоресцентных меток с учётом длительности их жизни. Визуализации FLIM позволяет различать флуоресценцию, исходящую от различных флуорохромов, и аутофлуоресценцию молекул образца, даже если они имеют схожий спектр излучения. Поэтому система используется для идентификации флуорофоров в исследованиях с несколькими метками. Визуализация FLIM применяется для изучения пространственных и временных белок-белковых взаимодействий, свойств мембран и взаимодействий с нуклеиновыми кислотами в живых клетках при проведении исследования. Метод системы FLIM также можно применять для получения информации об окружении флуорофора на основе изменения его времени жизни[3]. При обработке данных следует учитывать разнообразные факторы, влияющие на динамику испускания фотона флуорохромами, в том числе особенности химического состава клеток и тканей.[4]

Визуализация FLIM собирается на основе конфокальных и мультифотонных микроскопов, а также на флуоресцентных микроскопах широкого поля. Сканирующие микроскопы обеспечивают более высокое разрешение, с другой стороны, в эпифлуоресцентном режиме данные по всем наблюдаемым областям собираются единовременно. Детекция систем FLIM может быть совместима с микроскопией сверхвысокого разрешения на основе подавления спонтанного излучения (STED)[3].

Время жизни флуорохромов, используемых в качестве меток, длится 10-9 -10-6 секунд [3]. Это определяет требования к детекторам, используемым системой FLIM, поскольку требуется быстрое получение изображений. Мультиканальные фотоумножители, лавинные фотодиоды, высокоскоростные фоторегистраторы с синхронизированной развёрткой и камеры ПЗС с захватом изображения 200 пс могут использоваться для этих целей[1].

Системы позволяют измерять время жизни флуоресценции двумя способами. Пространственно-временной подход используется, преимущественно для исследований in vivo. При этом эмиссия оценивается как функция от времени с момента импульса. Используется какой-либо из способов сканирующей микроскопии и высокочастотный лазер[1]. Продолжительность импульса применяемых лазеров измеряется наносекундами и должна быть сопоставима с продолжительностью импульса применяемых лазеров[3].

При использовании частотного метода детектор активен, пока система не приняла флуоресцентный импульс[1]. При этом синусоидально модулированное освещение источника возбуждения вызывает доступный измерению сдвиг фазы флуоресценции и уменьшение амплитуды. Система позволяет вычислить время жизни флуоресценции на основе этих данных[1],[3].

Пространственное разрешение систем, основанных на применении резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) при использовании метода FLIM повышается, поскольку с помощью него можно более точно охарактеризовать взаимное пространственное расположение флуорохромов[3]. В этом случае учитывается изменение длительности флуоресценции донора и акцептора[4]. Система FLIM-FRET может применяться для оценки изменения конформации белка[3]. Длительность флуоресценции донорного флуорохрома при резонансном переносе энергии падает. Используя систему FLIM для оценки этого явления в визуализации, достаточно, в принципе, оценивать изменения длительности жизни одного флуорохрома[4]. Сходным образом оценивается подавление флуоресценции нефлуоресцентными гасителями, такими как REACh1 или REACh2[2].

Устройства, адаптированные для научных исследований с применением микроскопии, система FLIM используются и для решения задач практической медицины при визуализации. Метод позволяет исследовать системами атеросклерозные бляшки, в состав которых входит большое количество различных аутофлуоресцентных молекул, в свежем материале, полученном при операции, с целью определения их химического состава[1]. Системы для оценки аутофлуоресценции при эндоскопии методом FLIM также были разработаны и могут применяться в диагностике рака при локализации, доступной тем или иным образом для осмотра или эндоскопии, заболеваний глаз и сердечно-сосудистых заболеваний. Подход основан на том, что в опухолях и при других повреждениях тканей изменяется профиль аутофлуоресценции, в частности, злокачественное перерождение сопровождается изменением содержания NAD(P)H и FAD[1].

 

Изображение, полученное с использованием метода FLIM визуализации

 

 

 

  1. Marcu L1. Fluorescence lifetime techniques in medical applications / Ann Biomed Eng.-2012 Feb; N.40, V.2. - P.304-31.
  2. Ebrecht R, Don Paul C, Wouters FS. Fluorescence lifetime imaging microscopy in the medical sciences / Protoplasma.-2014. - N.251, V.2. -P.293-305. 
  3. Ishikawa-Ankerhold HC, Ankerhold R, Drummen GP. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM / Molecules.- 2012. - N.17, N. 4. -P. 4047-4132.
  4. Rahim NA, Pelet S, Kamm RD et al. Methodological considerations for global analysis of cellular FLIM/FRET measurements / J Biomed Opt.-2012. -N.17, V.2.

Полезная информация:

Микроскопы Нижний Новгород

Микроскоп купить Екатеринбург

Какой выбрать микроскоп

 

Вернуться наверх
Обратный звонок
Напишите нам