Медико-биологические микроскопы Nikon
Москва
+7 (495) 787 40 46
Санкт-Петербург
+7 (812) 305 06 06

Методы оптогенетики

Методы оптогенетики используют оптические и биотехнологические решения для управления сложно организованными живыми системами. Биологический компонент таких систем включает молекулы, способные к восприятию светового сигнала [1]. Оптогенетика используется для исследований поведения животных, развития эмбрионов, работы с кардиомиоцитами, изучения иммунной системы, а, в перспективе, возможно, будет применяться и для лечения различных заболеваний. Методический подход позволяет работать не только с клеточными культурами, но и наблюдать изменения поведения при стимуляции тех или иных участков мозга у свободно движущихся животных[2]. Оптогенетические технологии могут использоваться при работе с эмбрионами, например, прозрачными эмбрионами D.rerio, для вмешательства в процессы развития организма[3]. Локализация, длительность и интенсивность воздействия света, в отличие, например, от химических веществ, может быть рассчитана и проконтролирована, а также быть обратима, что выводит процесс стимуляции на новый уровень точности[4].

Традиционно, фотоактивация нейронов проводилась с помощью молекул, содержащих фоточувствительные химические связи. Разрыв этих связей под действием света приводит к переходу молекулы в активную форму и запуску того или иного биологического процесса. Такие фоточувствительные соединения до активации должны быть биологически инертны и обладать способностью проникать через мембраны клеток. Так могут быть модифицированы АТФ, нейротрансмиттеры, ретиноевая кислота. Метод более применим для низкомолекулярных соединений, чем для белков, поскольку модифицированные белки сложно ввести в клетку, без её повреждения. Однако с применением технологий биоинженерии он был адаптирован и для работы с белками. Получить фотоактивируемые белки при трансляции в клетке можно используя фоточувствительные аминокислоты, но есть риск, что такие аминокислоты не будут включаться в белковые цепи, их присутствие заблокирует синтез белка в клетке или повлияет на работу белковых молекул[3]. Разработаны фоточувствительные аналоги тирозина, цистеина, серина и лизина, которые могут быть встроены в белки путём манипуляций с генетическим кодом[5]. Ограничением технологии является то, что встраивание фоточувствительных аминокислот не позволяет проводить дезактивацию белка после стимуляции[4].

Одной из основных сфер применения оптогенетики является нейробиология. Поскольку для активации и блокирования работы нейрона важно распределение зарядов на мембране, транспортёры, меняющие тем или иным путём разность потенциалов на мембране клеток под действием света, могут быть использованы для исследования этих клеток. Канальные родопсины неспецифично проводят катионы при стимуляции видимым светом, приводя к деполяризации мембраны[1]. Они обеспечивают пассивное поступление в клетку ионов натрия, и, в меньшей мере, кальция[2]. Напротив, с использованием галородопсинов можно стимулировать светом поступление в клетку хлорид-ионов, что приводит к гиперполяризации мембраны и инактивации нейрона[3]. Преимуществом использования транспортёров хлора, является то, что хлор не входит во внутриклеточные сигнальные пути. Протонные помпы архей Arch и ArchT ведут к гиперполяризации, выводя протоны из клетки, этот эффект быстрее восстанавливается после прекращения воздействия, по сравнению с галородопсинами[2]. Вызываемые активацией Arch колебания pH переносятся клеткой лучше, благодаря тому, что они ограничены в определённом диапазоне, в отличие от неконтролируемого поступления ионов через канальные родопсины[1]. Модификация с использованием сразу двух фоточувствительных каналов позволяет как «включать», так и «выключать» работу того или иного механизма. Например, могут ChR2 и NpHR могут использоваться в сочетании. Мутации фоточувствительных каналов могут влиять на их эффективность, скорость переключения[2]. ChETA (ChR2/E125T) – мутантная форма белка, фоточувтсвительность и скорость открытия канала которой повышены по сравнению с диким типом. (21068304)

С помощью родопсинов и подобных им белков можно не только управлять потенциалом на мембране, но и вмешиваться в сигнальные пути различных рецепторов. Химерные конструкции, содержащие в своём составе компоненты родопсина и рецепторов, связанных с G-белками, так, что при этом внутриклеточные домены родопсина заменяются на внутриклеточные домены того или иного рецептора позволяют стимулировать клетки ненервной природы[2].

В оптогенетических системах можно контролировать и белок-белковые взаимодействия[6]. Для этого используются фоточувствительные рецепторы и их домены: фитохромы, криптохромы, белки, содержащие домены LOV. Фитохромы воспринимают красные и дальние красные световые сигналы. К какому сигналу восприимчив рецептор, зависит от внешних условий: в темноте и при освещении дальним красным светом, они воспринимают красный свет, и, напротив, в красном освещении будут восприимчивы к дальнему красному свету [4,6]. PhyA и PhyB – фитохромы растений. в активированном светом состоянии они связываются с транскрипционным фактором PIF. С помощью фрагментов этих белков можно создавать системы, в которых взаимодействие исследуемых компонентов будет контролироваться освещением[4]. Соединяя с фиохромами и PIF различные части транскрипционных факторов, можно управлять экспрессией в клетках с помощью света[7]. Более длительное освещение ведёт к большему накоплению конечного продукта. Димеризация Phy-PIF может использоваться и для пространственного контроля белка, например, привлечения его к мембране, контролируемой сборке системы сплайсинга[4].

Светочувствительные домены регулируют работу белка, изменяя его конформацию, чаще всего в оптогенетике для этого используют домен LOV2, благодаря его малому размеру, и выраженности преобразований, происходящих в нём под действием света. Домены LOV найдены у растений в составе различных белков, отвечающих за фототропизм, и участвующих в функционировании хлоропластов, у бактерий они задействованы в ответе на стресс, развитии и регуляции вирулентности. Механизмом их активации также может быть димеризация[6]. С помощью доменов LOV можно регулировать работу гистидин-киназ, ГТФаз, дигидрофолат-редуктаз, взаимодействие репрессоров с ДНК[4]. После прекращения стимуляции происходит возвращение к исходному состоянию – реверсия, скорость которой (минуты, секунды) у разных белков различна. Для некоторых процессов, например, связанных с активацией транскрипции, целесообразнее использовать белки, реверсия которых происходит в течении нескольких часов, а не секунд[6].

Криптохромы воспринимают синий и длинноволновый ультрафиолетовый свет[6]. Они регулируют процессы роста у растений и циркадные ритмы у животных. При освещении синим светом белок претерпевает конформационные изменения, обратимые при отсутствии освещения. Свет индуцирует взаимодействие криптохрома и CIB1[4].

Dronpa - фотопереключаемый зелёный флуоресцентный белок, отключаемый синим светом и активируемый фиолетовым за счёт цис-транс изменения структуры флуорохрома. В неактивном состоянии белок формирует тетрамеры. Присутствие компонентов Dronpa, формирующих тетрамер во фланкирующих доменах сконструированной белковой молекулы блокирует её активность в отсутствие освещения. (24059506)

Гомодимеры UVR8диссоциируют под действием ультрафиолетового света и мономеры могут связываться с COP1. Вызванные ультрафиолетом конформациионные изменения сохраняются несколько часов. Этот белок может применяться для контроля димеризации, например, с целью активации транскрипционных факторов, правда, в этом случае, клетки приходится подвергать неблагоприятному воздействию ультрафиолета.[7]

За счёт связывания субстратов белков с фоточувствительными соединениями можно контролировать их работу[3]. Антисмысловые олигонуклеотиды, инактивированные фоточувствительными связями, могут применяться для контроля транскрипции при помощи света[5].

Применение фоточувствительных белков также может потребовать дополнительных реагентов или генно-инженерных манипуляций с исследуемыми объектами. Для достижения требуемого уровня экспрессии в эукариотических клетках гены фоточувствительных белков могут потребовать адаптации кодонов для эукариотического организма, добавления последовательностей, определяющих внутриклеточный транспорт. Существуют линии мышей, в которых гены канальных родопсинов или галородопсины находятся под промоторами генов, активных во всех нейронах, или, например, в глутаматэргических нейронах[2]. Но не всегда одни и те же механизмы успешно реализуются во всех модельных объектах, например, успешно функционирующая в дрожжах димеризующаяся система phyB/PIF3 не подходит для привлечения на мембрану белковых молекул в клетках млекопитающих[6].

Как правило, в чувствительность фоторецепторов обусловлена кофакторами, их превращения под действием света влекут за собой конформационные изменения белка[2]. В родопсинах и фитохромах фотопереключение происходит путём цис-транс изомеризации в области двойной связи в хромофоре при абсорбции света. Криптохромы и белки, содержащие LOV домены активируются путём формирования производных при переносе электрона. Кофакторы фоточувствительных белков, за счёт которых они воспринимают свет, присутствуют в клетках организмов, из которых они были выделены, но могут отсутствовать у организмов-реципиентов. В таком случае они должны быть внесены в среду, или организмы-реципиенты должны быть модифицированы таким образом, чтобы синтез в них осуществлялся их синтез[6].

Способы стимуляции с одновременным наблюдением за ответом клеток под микроскопом могут быть различными. Возможна стимуляция канальных родопсинов в эпифлуорисцентном режиме с визуализацией активирующихся процессов в режиме сканирующей микроскопии. Стимуляция определённых участков может проводиться лазером сканирующего микроскопа с визуализацией в эпифлуорисцентном режиме. Точный паттерн активации могут обеспечить системы активного освещения, например, продукция компании Andor, позволяющая точно производить стимуляцию областей препарата, даже если они имеют сложную форму. В органах животного, например в мозге стимуляция фотоактивируемых клеток в определённом участке может проводиться, например, с помощью оптического волокна[2].

Оптогенетика может найти применение в нейропротезировании, лечении судорожных двигательных расстройств и нейродегенеративных заболеваний. Стимуляция переферических нервов используется для лечения паралича и заболеваний мышц. Оптическая стимуляция была бы более предпочтительна, чем электростимуляция, особенно при работе с небольшими медленно реагирующими мышечными волокнами. Оптогенетическая система была применена и для стимуляции кардиомиоцитов. Кроме того, встраивание канальных родопсинов в мембрану плюрипотентной клетки может использоваться для регуляции поступления кальция, что позволяет управлять процессом её дифференцировки в нейроны. Такое управление дифференцировкой является более щадящим, по сравнению с обработкой химическими веществами и создаёт меньше рисков для злокачественного перерождения[2].

 

 

  1. Knöpfel T, Lin MZ, Levskaya A, et al. Toward the second generation of optogenetic tools / J Neurosci. - 2010. V30, N.45.- P.14998-5004.
  2. Rein ML1, Deussing JM. The optogenetic (r)evolution / Mol Genet Genomics. - 2012.- V.287, N.2. - P.95-109.
  3. Feng Z1, Zhang W, Xu J et al. Optical control and study of biological processes at the single-cell level in a live organism / Rep Prog Phys. - 2013.- V.76. N.7
  4. Riggsbee CW1, Deiters A.Recent advances in the photochemical control of protein function / Trends Biotechnol. - 2010. V.28, N.9. - P.468-75.
  5. Gardner L1, Deiters A. Light-controlled synthetic gene circuits / Curr Opin Chem Biol. - 2012.- V.16, N. 3-4. - P292-9.
  6. Kim B, Lin MZ. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering / Biochem Soc Trans. 2013. - V41, N.5. - P.1183-8.
  7. Pathak GP1, Vrana JD, Tucker CL.Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors / Biol Cell. - 2013. - V.105, N.2. - P.59-72.
  8. Принцип работы оптогенетической системы на обложке журнала Science - стимуляция клеток светом лазера, 2009.V.326, N.595.1

Полезная информация:

Люминесцентный микроскоп

Флуорохромы

Цифровой микроскоп купить

 

Вернуться наверх
Обратный звонок
Напишите нам