Медико-биологические микроскопы Nikon
Москва
+7 (495) 787 40 46
Санкт-Петербург
+7 (812) 305 06 06

Двухфотонная микроскопия и другие технические решения в иммунологических исследованиях.

Клетки иммунной системы, в отличие от большинства клеток взрослого организма, очень подвижны [1]. В течение жизни они перемещаются из костного мозга в тимус и периферические лимфатические узлы, контактируют с большим количеством разнообразных клеток, при этом контакт может продолжаться несколько часов или считанные минуты [2]. В результате таких контактов изменяются профили экспрессирующихся в клетках иммунной системы генов, набор белков на мембране и секретируемых молекул. Благодаря возможности исследовать клетки иммунной системы на молекулярном уровне, было установлено, что морфологически сходные клетки, например дендритные клетки, могут быть представлены несколькими различными популяциями, разделить которые можно лишь с помощью нескольких флуоресцентных меток [1].

Происходящие в иммунной системе сложные взаимодействия, которые лежат в основе её работы, были описаны, во многом – на уровне предположений о реально протекающих процессах, на препаратах, в том числе, полученных путём замораживания и в клеточных культурах. Однако реальную картину такими методами не отразить, поскольку все описываемые процессы протекают в сложной трёхмерной структуре лимфатического узла. Трёхмерные коллагеновые носители могли бы использоваться в качестве материала, формирующего трёхмерное пространство, но, в норме, лимфоциты в лимфатических узлах не контактируют с коллагеном – он экранируется клетками стромы и синтезируемыми ими белками. Кроме того, в организме, даже в ограниченном пространстве лимфатического узла, клетки находятся в постоянном взаимодействии с другими клетками и градиентами синтезируемых ими молекул [1]. Скорость биологических взаимодействий серьёзно ограничивает возможности их исследования, поскольку они могут происходить в течение отрезков времени, измеряемых фемтосекундами [3].

Использование структурированного освещения (SIM) и стохастической оптической реконструкции (STORM) позволяет повысить разрешающую способность прижизненной микроскопии, но они применяются к тонким слоям клеток. Большинство современных методов микроскопии не позволяют проникнуть на глубину более 200 -300 микрон под поверхностью плотной ткани, такой как лимфатический узел. Сегодня объективы с наибольшими значениями числовой апертуры не позволяют получить изображение, размер деталей которого не менее нескольких сотен нанометров, но из-за малых рабочих расстояний такие объективы неприменимы для прижизненных исследований [3].

Двухфотонная микроскопия - метод позволяющий «проникать» в глубину материала, получая изображения ткани более чем на 1 мм в глубину. Он может применяться для исследования взаимодействий клеток в изъятых из организма лимфатических узлах или прижизненно, в лимфатических узлах животного под анестезией, с сохранением потока крови через узел [1]. Импульсы пикосекундного лазера, длина волны которого близка к инфракрасной области спектра, фокусируются на определённом участке образца. Когда два фотона поглощаются красителем, наблюдается эмиссия фотона с меньшей длиной волны. Длинноволное излучение глубже проходит в ткань и меньше повреждает её. Так микроскоп сканирует определённое поле зрения на различной глубине и возвращается в исходную точку, повторяя цикл, чтобы описать происходящее под объективом в динамике [2]. Длинноволновые фотоны меньше подвержены рассеиванию и поглощению [3].

Ряд технических решений может позволить расширить возможности методов визуализации клеток иммунной системы. Использование фотопереключаемых белков в сочетании с системами активного освещения, например, позволяет выделить из популяции конкретную клетку и отслеживать её перемещения и взаимодействие с другими клетками. Можно селективно пометить отдельные клетки, которые взаимодействуют с дендритными клетками и отследить дальнейшее их поведение [2]. Системы адаптивной оптики могут потребоваться  при наблюдении за процессами происходящими in vivo. Это приборы, позволяющие снизить влияние искажения света, которое возникает из-за того, что световые волны неравномерно распространяются в живых тканях [3].

В лимфатических узлах протекают важные процессы, связанные с работой иммунной системы. Лимфоциты попадают в узлы с током крови и, через несколько часов или дней покидают узел по лимфатическим сосудам, если не происходит их встречи с антигеном. Но когда антиген присутствует, ответ Т- и В-клеток включает выработку антител, пролиферацию, дифференцировку. [2].

Ключевой этап в развитии адаптивного иммунного ответа – взаимодействие дендритных клеток с CD4+ и CD8+ Т-клетками. С помощью систем in vitro было проведено множество экспериментов, целью которых было выяснение длительности этого контакта, но результаты их были крайне противоречивы и различались во много раз, поскольку полноценно воссоздать как сложную структуру лимфатического узла, так и состав среды вне организма не возможно. Только микроскопия высокого разрешения, позволившая визуализировать процесс в живом организме и проследить дальнейшую судьбу клеток, позволила пролить свет на этот процесс. CD4+  и CD8+ Т-клетки формируют стабильные, длительные, антиген-зависимые контакты с дендритными клетками, длящиеся по многу  часов. Такие длительны е взаимодействия Т-клеток и дендритных клеток предшествуют экспансии Т-клеток и ими выделению цитокинов, активации дендритных клеток. Это цепь взаимодействий, поэтапно меняющих профили экспрессии в контактирующих клетках [1]. Однако между Т-клетками и дендритным клетками возможны и кратковременные контакты, значение которых пока не ясно [1]. Согласно одной из гипотез, короткие взаимодействия Т-клеток с дендритными клетками определяют иммунологическую толерантность [2].

Антиген может присутствовать в виде молекул, частиц микроорганизма в кровотоке и быть связанным на молекулах главного комплекса гистосовместимости. Так или иначе, он распознаётся рецепторами на B-клетках. С помощью двухфотонной микроскопии удалось описать дальнейшие события. Активированные B-клетки движутся к краю фолликулов. Это оказалось не прямолинейным движением, а довольно сложным процессом.. B-клетки случайным образом перемещаются в фолликуле. пока они не достигнут расстояния 100-200 мкм до его поверхности. Здесь их рецепторы распознают градиент хемокинов, по которому они движутся к Т-клеткам, взаимодействие кс которыми начинается на краю фолликула, после чего обе клетки уходят в фолликул, вернее, B-клетки движутся вглубь фолликула, а Т-клетки движутся за ними пассивно. [2].

Работу иммунной системы необходимо исследовать не только в лимфоидной ткани, ведь её функционирование захватывает все ткани организма. Вне лимфатических узлов идёт захват и трансфер антигенов в лимфатические узлы, миграция клеток, реакции воспаления и регуляция иммунной системой. Большая часть лимфоцитов организма сосредоточена в кишечнике, это Т и B клетки, а также несколько популяций дендритных клеток. Визуализация клеток иммунной системы возможна в различных тканях: коже, печени, сетчатке, мезентерии. Однако высокие показатели светорассеяния и светопоглощения паренхимы органов затрудняют наблюдение протекающих в ней процессов, причём каждый орган, каждая ткань уникальны в этом отношении. С помощью двухфотонной микроскопии была изучена поверхность подвздошной кишки. Как ранее уже было установлено, дендритные клетки могут образовывать выросты, просвет кишечника. Там эти выросты приобретают сферическую форму, захватывают бактерии и обеспечивают их транспорт к телу клетки [1].

Технологии визуализации процессов, протекающих в иммунной системе, могут представлять интерес и для исследования воздействия на иммунную систему лекарственных препаратов, например, установить на какие именно мишени и в какой группе клеток они воздействуют. [2]. Также можно исследовать и взаимодействия между организмом хозяина и патогеном. Двухфотонная микроскопия позволяет увидеть патогена в очаге воспаления, что непросто, поскольку такой материал содержит множество клеток иммунной системы, окружающих чужеродный потенциально опасный объект [2].  Флуоресцентные сигналы, возникающие в клетках иммунной системы трансгенных животных, содержащих ген GFP, под тем или иным промотором могут быть визуализированы прижизненно с помощью двухфотонной микроскопии [1]. Таким образом, двухфотонная микроскопия и другие высокотехнологичные решения, дающие возможность прижизненного наблюдения,  позволяют достоверно описать процессы, протекающие в ходе иммунного ответа, подтвердить или опровергнуть высказывавшиеся ранее гипотезы, получить новые научные данные.

 

  1. Germain RN, Castellino F, Chieppa M et al. An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging. Semin Immunol. 2005;17(6):431-41. Epub 2005 Oct 10.
  2. Germain RN, Robey EA, Cahalan MD. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 2012; 336(6089):1676-81.
  3. Tang J, van Panhuys N, Kastenmüller W et al The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur J Immunol. 2013;43(6):1407-12.

 

Т-клетка (голубая) взаимодействует с B-клеткой в лимфатическом узле. Двухфотонная микроскопия (по материалам Кембриджского Университета)

 

Дендритные клетки в почке мыши. Двухфотонная микроскопия (по материалам Кембриджского Университета)

Полезная информация:

Купить микроскоп в Москве

Микроскоп для эмбриологии

Какой выбрать микроскоп

Вернуться наверх
Обратный звонок
Напишите нам